青海大学药学院联合中国科学院西北高原生物研究所中藏药活性成分发掘研究团队发表

应用新型HPLC-FLD/胰脂肪酶在线识别系统在生物活性导向下定向分离黑果枸杞中胰脂肪酶抑制剂的研究成果

青海大学药学院联合中国科学院西北高原生物研究所中藏药活性成分发掘研究团队在新锐一区TOP期刊《Food Chemistry》（IF = 10.4）发表题为《Bioactivity-guided isolation of pancreatic lipase inhibitors from Lycium ruthenicum using a novel HPLC-FLD/pancreatic lipase online recognition system》的研究成果。硕士生李瑛为第一作者，党军研究员为通讯作者。

一、研究意义

胰脂肪酶是人体脂质消化吸收的关键酶，抑制该酶活性可减缓脂质吸收，在肥胖等代谢性疾病防控中发挥重要作用。黑果枸杞中富含花青素等活性成分，已有研究证实其粗提物具有胰脂肪酶抑制活性，但针对活性单体研究报道较少。酶学方法和固定化胰脂肪酶法等应用于天然产物中胰脂肪酶抑制剂筛选时，面临周期长和微量成分漏筛选等共性问题。基于以上问题，本研究构建了新型HPLC-FLD/胰脂肪酶在线识别系统，从黑果枸杞中定向分离得到2个高纯度的矮牵牛素花色苷类胰脂肪酶抑制剂，为天然产物中胰脂肪酶抑制剂的发现与新型识别平台搭建提供了新的研究思路。

二、研究内容与结果

1、HPLC-FLD/胰脂肪酶在线识别系统构建与优化

本研究利用荧光光谱仪对胰脂肪酶的最佳激发波长进行检测，选择不同条件的胰脂肪酶溶液输送泵（C泵）流速和胰脂肪酶溶液浓度来考察对识别结果的影响，通过阳性药物奥利司他完成系统有效性验证。结果显示，胰脂肪酶的最佳激发波长为221 nm，发射波长为303 nm。负峰面积随着C泵流速的增加而增加，但流速增至1.2 mL/min ，负峰面积开始减小，确定C泵的流速为1 mL/min。负峰面积随着胰脂肪酶浓度的增加而逐渐增加，但胰脂肪酶浓度为150 μg/mL时，负峰面积开始下降，确定胰脂肪酶溶液浓度在12.5 μg/mL ~ 70 μg/mL范围内。当奥利司他样品与C泵中的胰脂肪酶溶液汇合，两者发生结合使胰脂肪酶的荧光吸收降低，在荧光检测器上形成负峰，说明建立的在线识别系统是有效的。

图 1 HPLC-FLD/胰脂肪酶抑制剂在线识别系统的构建

2、黑果枸杞中胰脂肪酶抑制剂的定向分离

考虑到高有机相比例对胰脂肪酶稳定性的影响，该研究使用Odyssil C18和Kromasil 60-5-HILIC-D分析柱对黑果枸杞样品进行在线识别。结果显示，在C18色谱模式下，共识别出2个目标色谱峰。在HILIC色谱柱梯度洗脱过程中，乙腈浓度从90%降至65%，负峰的吸收随着胰脂肪酶浓度的增加而呈比例增加，共识别出了2个目标色谱峰。研究发现使用C18和HILIC色谱柱时识别出的活性色谱峰数量相同，且负峰吸收结果大致相当，这表明乙腈对胰脂肪酶活性的影响较小。该在线系统可应用于C18和HILIC两种洗脱模式，并为高极性化合物的胰脂肪酶抑制剂识别提供了新的见解。

本研究选用自组装100 × 1000 mm规格色谱柱应用于黑果枸杞中活性化合物的靶向富集。结果显示，不同极性的活性成分逐步分离，共获得了5个馏分。各级馏分减压浓缩后，在相同的分析条件下，使用Odyssil C18分析柱和Kromasil HILIC-D分析柱对黑果枸杞总样、馏分Fr1–Fr5进行了对比分析，各馏分之间的交叉污染极小，目标活性化合物p1和p2成功实现靶向富集于Fr3和Fr5馏分中。该实验结果进一步验证了自组装100 × 1000 mm C18色谱柱的高效富集性能。

图 2 黑果枸杞中胰脂肪酶抑制剂的中压反相色谱靶向富集

馏分Fr3在Odyssil C18分析柱的色谱图显示，目标色谱峰p1和红色虚线框1和2中化合物的极性相近，难以满足高效分离需求。但在Kromasil HILIC-D分析柱上成功分离为多个独立色谱峰，且分离度良好，在目标峰p1之前完成洗脱，有效实现了杂质与目标峰p1的基线分离。根据这个结果，选择亲水性色谱柱对馏分Fr3和Fr5进行制备，以实现后续复杂馏分的高效分离，进一步提升目标化合物的纯化效率与纯度。馏分Fr3和Fr5选择Click XION制备柱进行等度洗脱。结果显示，馏分Fr3和Fr5的收集部分对应于紫色方框划分的色谱区域，标记为Fr31和Fr51。Odyssil C18分析柱和Kromasil HILIC-D色谱柱对黑果枸杞和所得馏分进行对比分析，锁定目标峰p1和p2在馏分Fr31和Fr51中。

图 3 黑果枸杞中胰脂肪酶抑制剂的中压亲水色谱定向分离

选择用Sephadex LH-20色谱柱精制馏分Fr31和Fr51，收集紫色区域馏分减压浓缩干燥，得Fr311和Fr511。为验证从黑果枸杞中分离得到的目标组分Fr311与Fr511的纯度及胰脂肪酶抑制活性，采用HPLC-MS/MS对两种化合物进行纯度测定，同时结合HPLC-FLD/胰脂肪酶在线识别系统评估其胰脂肪酶抑制活性。结果显示，锁定目标色谱峰p1和p2在馏分Fr311和Fr511中。Fr311的m/z: 1095.3[M]⁺，Fr511的m/z: 933.2[M]⁺。分析结果表明，这两种化合物的纯度约为95%。通过HPLC-FLD/胰脂肪酶在线识别系统的活性色谱峰精准识别，结合中压色谱定向分离，成功从黑果枸杞中分离得到2个高纯度的胰脂肪酶抑制剂。

图 4 黑果枸杞中胰脂肪酶抑制剂的中压LH-20色谱精制

3、黑果枸杞中胰脂肪酶抑制剂的结构表征

Fr311为紫色粉末，20 mg；ESI-HRMS m/z: 1095.3269 [M]⁺, 分子式为C₄₉H₅₉O₂₈，精确分子量为1095.3200。NMR数据与文献数据比对，Fr311鉴定为petunidin 3-O-(glucosyl-trans-p-coumaroylrutinoside)-5-O-glucoside。Fr511为紫色粉末，18 mg；ESI-HRMS m/z: 933.2101 [M]⁺, 分子式为C₄₃H₄₉O₂₃，精确分子量为933.2659。NMR数据与文献数据比对，Fr511鉴定为Petunidin-3-O-(trans-p-coumaroylrutinoside)-5-O-glucoside。

图 5 黑果枸杞中胰脂肪酶抑制剂的结构表征

4、黑果枸杞中胰脂肪酶抑制剂的活性验证

体外酶学和分子对接实验对定向分离得到的2个胰脂肪酶抑制剂做进一步的活性验证。结果显示，奥利司他的半数抑制浓度（IC₅₀）6.38 ± 1.96 μM，Fr311的IC₅₀为 9.67 ± 0.82 μM，Fr511的IC₅₀为147.37 ± 0.75 μM。奥利司他、Fr311和Fr511的预测的结合能分别是-4.64 kcal/mol、-13.12 kcal/mol和-12.22 kcal/mol，化合物都能很好的进入口袋与酶对接，Fr311与胰脂肪酶的结合能优于Fr511，这与酶学实验结果一致。奥利司他、Fr311和Fr511与胰脂肪酶中的关键氨基酸残基形成氢键，发挥胰脂肪酶抑制效果。酶学实验和分子对接结果表明， HPLC-FLD/胰脂肪酶在线识别系统具有良好的可靠性，可应用于天然产物中胰脂肪酶抑制剂的高效发现。

图 6 黑果枸杞中胰脂肪酶抑制剂的活性验证

三、重要结论

该研究整合了HPLC-FLD/胰脂肪酶在线系统的精准识别和中压色谱定向分离的2种策略，从黑果枸杞中共分离得到2个高纯度矮牵牛素花色苷胰脂肪酶抑制剂。系统关键参数优化中，C泵流速确定为1 mL/min、胰脂肪酶浓度范围为12.5 ~ 70 μg/mL。该系统可在C18与HILIC两种洗脱模式下实现胰脂肪酶活性色谱峰的识别，拓宽了识别样品的极性范围段,为天然产物中胰脂肪酶抑制剂高效发现提供了新的思路。

Li Ying, Zhang Yu, Zhang Li, et al. Bioactivity-guided isolation of pancreatic lipase inhibitors from Lycium ruthenicum using a novel HPLC-FLD/pancreatic lipase online recognition system [J]. Food Chemistry, 2025: 147031. DOI: 10.1016/j.foodchem.2025.147031